泛素結合酶elisa方法(fa)說明書 實(shi)驗原理: 本試劑盒應用雙抗體夾心法測(ce)定標本中(zhong)血清素/血清胺(ST)水平。用純化的(de)血清素/血清(qing)胺(ST)抗體包被微(wei)孔(kong)板，制成固相抗體，往包被單抗的微(wei)孔(kong)中依次加入血清素/血清胺(ST)，再與HRP標記的血清素(su)/血清胺(ST)抗(kang)體結合，形(xing)成抗(kang)體-抗原-酶標抗體復合物，經(jing)過徹di洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶S的(de)催(cui)化下(xia)轉化成藍色(se)，并在(zai)酸的(de)作用下(xia)轉化成最終的(de)黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深淺和樣品中的(de)血(xue)清素/血清胺(ST)呈正相(xiang)關。用酶(mei)標儀(yi)在450nm波長下(xia)測定吸光(guang)度（OD值），通過標(biao)準曲線(xian)計算(suan)樣(yang)品中(zhong)血清素(su)/血清胺(an)(ST)濃度。 試(shi)劑盒組成(cheng) : 1、30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶(ping) 7 終止液 6ml×1瓶 2、酶標試劑 6ml×1瓶 8 標準品（160pg/ml） 0.5ml×1瓶 3、酶標包被(bei)板 12孔×8條(tiao) 9 標準品稀釋液 1.5ml×1瓶(ping) 4、樣品稀釋(shi)液(ye) 6ml×1瓶 10 說(shuo)明書 1份 5、顯色劑(ji)A液 6ml×1瓶(ping) 11 封板膜 2張 6、顯色劑B液(ye) 6ml×1/瓶 12 密封(feng)袋 1個 標本要求(qiu): 1．標(biao)本采集(ji)后盡(jin)早進行(xing)提(ti)取(qu)(qu)，提(ti)取(qu)(qu)按相關文獻進行(xing)，提(ti)取(qu)(qu)后應盡(jin)快進行(xing)實(shi)驗。若不能馬(ma)上進行(xing)試驗，可將標(biao)本放于(yu)-20℃保存，但應避免反復凍融(rong) 2．不能檢測含NaN3的(de)樣品，因(yin)NaN3抑制辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)的（HRP）活性。 樣本處(chu)理及要求(qiu)： 1.血(xue)清：全(quan)血(xue)標本請于(yu)室溫放置(zhi)2小時或4℃過(guo)夜后于(yu)1000g離心20分鐘(zhong)，取(qu)上清即可檢(jian)測，或將標本放于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 2. 血漿：可用(yong)EDTA或(huo)肝素(su)作(zuo)為抗凝劑，標(biao)本(ben)采集(ji)后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或(huo)將標(biao)本(ben)放于-20℃或(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反復(fu)凍融。 3. 組(zu)織勻漿(jiang)：用預(yu)冷(leng)的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織，去除殘留血液(ye)(ye)（勻漿(jiang)中裂(lie)解的(de)(de)紅細胞(bao)會影響(xiang)測量(liang)結果(guo)），稱重后將(jiang)組(zu)織剪碎。將(jiang)剪碎的(de)(de)組(zu)織與對(dui)應(ying)體(ti)積(ji)的(de)(de)PBS（一般(ban)按1:9的(de)(de)重量(liang)體(ti)積(ji)比，比如1g的(de)(de)組(zu)織樣(yang)品對(dui)應(ying)9mL的(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加(jia)入蛋白(bai)酶抑制劑）加(jia)入玻璃勻漿(jiang)器中，于冰上充分(fen)研(yan)磨。為(wei)了(le)進一步裂(lie)解組(zu)織細胞(bao)，可以對(dui)勻漿(jiang)液(ye)(ye)進行超聲破碎，或反復凍融。將(jiang)勻漿(jiang)液(ye)(ye)于5000×g離心5~10分(fen)鐘(zhong)，取上清檢測。 4. 細胞培養物上(shang)清或(huo)其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上(shang)清即可檢測，或(huo)將標本放于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。 試劑盒特點: 1、高效、靈(ling)敏、特異(yi)的抗體(ti); 2、穩定(ding)的(de)重(zhong)復(fu)性(xing)和可靠性(xing); 3、吸附性能好，空白值低，孔底透明度(du)高(gao)的固(gu)相載體(ti); 4、適用血清、血漿、組織勻漿液(ye)、細(xi)胞培養上清液(ye)、尿(niao)液(ye)等等多種標本類(lei)型(xing); 5、節省實驗經費。 試(shi)劑(ji)盒性能(neng)： 1. 靈敏度(du)：zui小(xiao)的(de)檢(jian)測(ce)濃度(du)小(xiao)于(yu)1號標準品(pin)。稀釋度(du)的(de)線(xian)性(xing)。樣(yang)品(pin)線(xian)性(xing)回歸與(yu)預期(qi)濃度(du)相關(guan)系數R值為0.990。 2. 特(te)異性：不與其它細胞因子反應(ying)。 3. 重復(fu)性：板(ban)內、板(ban)間變異系數均小于10%。 操作步驟： 1.標準品的稀(xi)釋：本試劑盒提供(gong)原倍標準品一(yi)支，用戶(hu)可按照下列圖(tu)表在小(xiao)試管中進(jin)行(xing)稀(xi)釋。 2.加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)：分別設(she)空白孔（空白對(dui)照孔不加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)及酶(mei)標(biao)試劑，其余各步(bu)操作(zuo)相同）、標(biao)準孔、待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)孔。在(zai)酶(mei)標(biao)包被板(ban)上標(biao)準品(pin)(pin)(pin)(pin)準確加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)50μl，待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)孔中先(xian)加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋液40μl，然(ran)后再加(jia)待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)最終稀(xi)釋度(du)為(wei)5倍）。加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)將樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)(pin)加(jia)于(yu)酶(mei)標(biao)板(ban)孔底部(bu)，盡(jin)量(liang)不觸及孔壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃動混勻。 3.溫育(yu)(yu)：用封板膜(mo)封板后(hou)置37℃溫育(yu)(yu)30分鐘(zhong)。 4.配液(ye)：將30倍(bei)濃縮洗滌液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水30倍(bei)稀釋后備用(yong) 5.洗滌：小心揭掉(diao)封板膜，棄去液(ye)體，甩干，每(mei)孔加滿洗滌液(ye)，靜置30秒(miao)后棄去，如此重復5次，拍(pai)干。 6.加(jia)酶：每孔加(jia)入酶標(biao)試劑50μl，空白孔除外。 7.溫育：操作同(tong)3。 8.洗滌：操作(zuo)同5。 9.顯(xian)色：每(mei)孔先加入(ru)(ru)顯(xian)色劑A50μl，再加入(ru)(ru)顯(xian)色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光(guang)顯(xian)色10分(fen)鐘. 10.終(zhong)(zhong)止(zhi)：每(mei)孔加(jia)終(zhong)(zhong)止(zhi)液50μl，終(zhong)(zhong)止(zhi)反應（此時藍色(se)立轉黃色(se)）。 11.測定：以空(kong)白(bai)孔調零，450nm波長依(yi)序(xu)測量各孔的吸(xi)光度（OD值(zhi)）。 測定應在加終(zhong)止液(ye)后15分鐘以內進(jin)行。 計算： 以(yi)標(biao)(biao)準(zhun)物(wu)的(de)(de)濃度(du)為(wei)橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)，OD值(zhi)(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)，在坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)紙上繪出(chu)(chu)標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)，根據(ju)樣品(pin)的(de)(de)OD值(zhi)(zhi)由(you)標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)查出(chu)(chu)相應的(de)(de)濃度(du)；再乘以(yi)稀釋倍數；或用(yong)標(biao)(biao)準(zhun)物(wu)的(de)(de)濃度(du)與OD值(zhi)(zhi)計(ji)算(suan)出(chu)(chu)標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)的(de)(de)直線(xian)回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)式，將樣品(pin)的(de)(de)OD值(zhi)(zhi)代(dai)入方(fang)程(cheng)式，計(ji)算(suan)出(chu)(chu)樣品(pin)濃度(du)，再乘以(yi)稀釋倍數，即為(wei)樣品(pin)的(de)(de)實際(ji)濃度(du)。 注意事項： 1．試劑盒從(cong)冷藏(zang)環境中(zhong)取出應在室溫平衡15-30分鐘后(hou)方可使用，酶標包被(bei)板(ban)開封后(hou)如未用完(wan)，板(ban)條(tiao)應裝(zhuang)入密封袋中(zhong)保存。 2．濃(nong)洗(xi)(xi)滌(di)液可能會有結晶析(xi)出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗(xi)(xi)滌(di)時不影(ying)響(xiang)結果。 3．各(ge)步(bu)加樣均應使用加樣器，并經常校對(dui)其準確性，以(yi)避免試驗誤差。一(yi)次加樣時間最好控制在5分鐘(zhong)內，如標本(ben)數量(liang)多，推(tui)薦使用排槍加樣。 4．請(qing)(qing)每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔(kong)。如標本(ben)中待測物質含(han)量(liang)過(guo)高（樣(yang)本(ben)OD值(zhi)大(da)于標準品孔(kong)第一孔(kong)的OD值(zhi)），請(qing)(qing)先用樣(yang)品稀(xi)釋液稀(xi)釋一定倍(bei)(bei)數（n倍(bei)(bei)）后再測定，計算(suan)時請(qing)(qing)最后乘以總稀(xi)釋倍(bei)(bei)數（×n×5）。 5．封板膜(mo)只(zhi)限(xian)一次性使用，以避免(mian)交叉污染。 6．底物(wu)請避光保存。 7．嚴格按照說明書的操(cao)作進行，試(shi)驗結(jie)果判定必須以酶標儀讀數為準. 8．所有樣品，洗滌液和各(ge)種廢棄物(wu)都(dou)應按(an)傳染物(wu)處理。 9．本試劑不同批(pi)號組分(fen)不得混(hun)用。 保存條(tiao)件及有效期:
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月。
| 
