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聚合酶鏈式反應（PCR）是(shi)一種用于放大(da)擴增特定的DNA片段(duan)的分(fen)子(zi)生物(wu)學技(ji)術，它可看作是(shi)生物(wu)體外的特殊(shu)DNA復(fu)制(zhi)，PCR的最(zui)大(da)特點是(shi)能將微量的DNA大(da)幅增加(jia)。PCR技(ji)術的基(ji)本(ben)原(yuan)理類(lei)似于DNA的天然復(fu)制(zhi)過程，其特異性(xing)依賴于與(yu)靶序(xu)列兩端互補(bu)的寡核苷酸引(yin)物(wu)。PCR反應常(chang)見問題(ti)分(fen)述如下：
1．假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：
①模板中含(han)有雜蛋白質，
②模(mo)板中含(han)有Taq酶抑制劑，
③模板中蛋白質沒(mei)有消化除凈，特別是染(ran)色體中的組蛋白，
④在提(ti)取制備模(mo)板(ban)時丟失過多，或(huo)吸入酚。
⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引(yin)物：引(yin)物質量、引(yin)物的濃度(du)、兩(liang)條(tiao)引(yin)物的濃度(du)是(shi)否(fou)對稱，是(shi)PCR失敗或擴增條(tiao)帶不理想(xiang)、容(rong)易彌散(san)的常見(jian)原因。有些(xie)批號的引(yin)物合成質量有問(wen)題，兩(liang)條(tiao)引(yin)物一條(tiao)濃度(du)高，一條(tiao)濃度(du)低(di)，造成低(di)效率的不對稱擴增，對策為(wei)：
①選定一個(ge)好的引物合成單位。
②引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的濃度(du)不僅(jin)要(yao)(yao)看OD值，更要(yao)(yao)注重引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)原液做(zuo)瓊脂糖凝膠(jiao)電泳，一(yi)定要(yao)(yao)有引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)條(tiao)帶出現，而(er)且兩引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)帶的亮度(du)應(ying)大(da)體一(yi)致，如一(yi)條(tiao)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)有條(tiao)帶，一(yi)條(tiao)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)無條(tiao)帶，此時做(zuo)PCR有可(ke)能失敗(bai)，應(ying)和引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)合(he)成(cheng)單位(wei)協商解決。如一(yi)條(tiao)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)亮度(du)高，一(yi)條(tiao)亮度(du)低(di)，在稀釋(shi)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)時要(yao)(yao)平衡其濃度(du)。
③引(yin)物使(shi)用過程中應高濃度小量(liang)分(fen)裝保存，防止(zhi)多次凍融或長期放(fang)冰箱冷(leng)藏部分(fen)，導致引(yin)物變質降解失(shi)效。
④引物設(she)計不合(he)理，如引物長(chang)度(du)不夠，引物之間形成二聚體(ti)等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μl后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。
物理原因：溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列(lie)(lie)變異：如靶序列(lie)(lie)發(fa)生突變或缺(que)失(shi)，影響引物(wu)(wu)與模板特異性結合，或因靶序列(lie)(lie)某段(duan)缺(que)失(shi)使引物(wu)(wu)與模板失(shi)去互補序列(lie)(lie)，其(qi)PCR擴增(zeng)是不會成(cheng)功的(de)。
2．假陽性
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴(kuo)增產物的交叉(cha)污染(ran)(ran)：這種(zhong)污染(ran)(ran)有兩種(zhong)原(yuan)因(yin)：一是整個基因(yin)組或大片(pian)段的交叉(cha)污染(ran)(ran)，導(dao)致(zhi)假陽(yang)性(xing)。這種(zhong)假陽(yang)性(xing)可用(yong)以下方法解決：
①操作(zuo)時(shi)應小心輕柔(rou)，防止將靶序列(lie)吸入(ru)加樣器內(nei)或濺出離(li)心管(guan)外。
②除了酶及其他不耐高(gao)溫(wen)的(de)物(wu)質(zhi)外(wai)，所有試劑或(huo)器材均應高(gao)壓(ya)消毒。所用(yong)離(li)心管及進樣槍頭(tou)均應一次性使用(yong)。
③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3．出現非特異性擴增帶
PCR擴(kuo)增后出現(xian)的(de)(de)條(tiao)(tiao)帶(dai)與(yu)(yu)預計(ji)的(de)(de)大小不一致，或(huo)大或(huo)小，或(huo)者同時出現(xian)特(te)異性擴(kuo)增帶(dai) 與(yu)(yu)非(fei)特(te)異性擴(kuo)增帶(dai)。非(fei)特(te)異性條(tiao)(tiao)帶(dai)的(de)(de)出現(xian)，其原因：一是引物與(yu)(yu)靶序(xu)列不wan全互補(bu)、或(huo)引物聚合形成二(er)聚體。二(er)是Mg2+離(li)子濃度過(guo)高、退火溫度過(guo)低，及PCR循環(huan)次(ci)(ci)數過(guo)多有關。其次(ci)(ci)，是酶的(de)(de)質和量，往(wang)往(wang)一些來(lai)源的(de)(de)酶易出現(xian)非(fei)特(te)異條(tiao)(tiao)帶(dai)而另一來(lai)源的(de)(de)酶則(ze)不出現(xian)，酶的(de)(de)量過(guo)多有時也會出現(xian)非(fei)特(te)異性擴(kuo)增。其對策有：
①必要時，重(zhong)新設計(ji)引(yin)物。
②減低酶的量或調換(huan)另一來源的酶。
③降低引物量，適(shi)當增加模板量，減少(shao)循環次數。
④適當(dang)提高(gao)退火溫度或采用(yong)二溫度點法(93℃變性，65℃左右(you)退火與延伸，也叫兩步(bu)法)。
4．出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增(zeng)有時出現涂抹帶(dai)(dai)或片狀帶(dai)(dai)或地毯樣帶(dai)(dai)。其(qi)原因往往由于酶(mei)的量過大或酶(mei)的質量差，dNTP濃度(du)過高，Mg2+濃度(du)過高，退火溫度(du)過低，循環(huan)次數過多引(yin)起(qi)。其(qi)對策有：
①減少酶(mei)的(de)量(liang)，或調換(huan)另一來源的(de)酶(mei)。
②減(jian)少(shao)dNTP的濃(nong)度。
③適當降低Mg2+濃 度。
④增加模板量，減少(shao)循環(huan)次數
